PENGARUH PENAMBAHAN BUBUK CABAI MERAH TERHADAP DENSITAS Weisella koreensis SELAMA PROSES FERMENTASI KIMCHI
Pengaruh Penambahan Bubuk Cabai Merah terhadap Densitas Weisella koreensis selama Proses Fermentasi Kimchi
Alifia Issabella Mulyawati
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya
Malang
ABSTRAK
Weisella koreensis merupakan bakteri psikrofil yang ditemukan mendominasi pada kimchi dan dapat membantu memberikan dampak anti-obesitas dengan cara memproduksi ornithin. Genom dari W. koreensis KACC15510 digunakan sebagai acuan untuk mengidentifikasi gen spesies spesifik untuk dijadikan sebagai target baru dalam proses deteksi dan kuantifikasi dari W. koreensis di dalam kimchi. Adanya primer spesifik Polymerase Chain Reaction (PCR) digunakan untuk mendesain gen protein membran dari W. koreensis KAC15510 dan untuk menginvestigasi sensitivitas dan spesifisitasnya dalam mendeteksi bakteri pada kimchi. Uji spesifisitas dilakukan menggunakan genomic DNA dari 8 isolat W. koreensis yang terdiri dari 11 spesies yang berbeda dalam genus Weisella dan 13 lainnya merupakan strain Bakteri Asam Laktat (BAL). Adanya penambahan bubuk cabai merah ternyata dapat berpengaruh kuat terhadap peningkatan densitas Weisella koreensis selama proses fermentasi pada kimchi.
Kata kunci: bubuk cabai merah, bakteri asam laktat, PCR, Weisella koreensis
BAB I
PENDAHULUAN
Weisella koreensis merupakan bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, heterofermentatif, non motil, dan memiliki sel berbentuk batang pendek yang termasuk dalam Leuconostocaceae. Bakteri tersebut merupakan jenis Bakteri Asam Laktat (BAL) yang dominan di produk makanan fermentasi berupa kimchi yang merupakan makanan tradisional dari Korea hasil fermentasi sayur (Moon, 2012). W. koreensis merupakan bakteri psikrofilik yang dapat memproduksi asam laktat dan metabolit lain dari glukosa untuk memberikan rasa dan tekstur yang khas pada kimchi (Choi dkk., 2012). Penelitian terbaru menunjukkan bahwa W. koreensis dapat menghambat proses germinasi pada mikroorganisme tertentu selama proses fermentasi terjadi dan dapat memberikan efek berupa anti-obesitas dengan cara memproduksi non-protein asam amino yang disebut dengan ornithin (Choi dkk., 2012). Pembuatan kimchi yang paling umum adalah dengan cara mencampurkan kubis putih yang telah diasinkan dengan pasta kimchi yang dibuat dari bubuk cabai merah (Capsicum annuum), bawang putih, daun bawang, jahe, minyak ikan, pasta zat tepung dan bahan tambahan seperti ikan segar. Terdapat lebih dari 100 spesies dari BAL dan beberapa strain khamir yang dapat diisolasi dari produk kimchi seperti Lactobacillus, Leuconostoc, dan spesies Weisella. Namun, penelitian menunjukkan bahwa Weisella koreensis merupakan spesies mikroorganisme yang memiliki peran paling penting dalam proses pembuatan kimchi (Choi dkk., 2012).
Deteksi adanya Weisella koreensis dalam berbagai produk makanan fermentasi sangat penting untuk dilakukan. Deteksi tersebut dapat dilakukan menggunakan metode yang akurat, cepat, sensitif, dan praktis berdasarkan metode reaksi rantai polymerase kuantitaif (qPCR). Uji secara molekular sudah banyak dilakukan menggunakan 16s RNA ribosom (rRNA) ataupun gen tertentu yang dapat mengkode suatu fungsi tertentu yang berhubungan dengan metabolisme dari mikroorganisme spesifik yang salah satunya digunakan untuk mengidentifikasi adanya spesies Weisella. Namun, uji tersebut belum sempurna karena hanya mampu mendeteksi Weisella dan semua spesiesnya saja tanpa mampu mendeteksi langsung pada spesies Weisella koreensis (Cho, 2009). Urutan sekuensing DNA sangat penting untuk menentukan efektivitas metode deteksi PCR (Cho, 2009).
Selama 10 tahun terakhir, berbagai upaya telah dilakukan untuk menentukan sekuen spesifik dari banyak strain Bakteri Asam Laktat (BAL). Adanya peningkatan jumlah sekuen genom BAL yang terdapat pada database peralatan bioinformatika menambah atau mengembangkan metode identifikasi yang lebih handal, cepat dan hemat biaya untuk identifikasi bakteri dalam berbagai jenis sampel. Namun, meskipun terdapat perkembangan dalam bioinformatika terkait identifikasi BAL oleh industri mikroorganisme tersebut tetap memiliki keterbatasan dalam menentukan atau mengidentifikasi suatu spesies spesifik dari jenis BAL yang ada pada suatu sampel. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, peneliti berusaha untuk mengeksploitasi informasi terkait urutan genom yang tersedia di database publik (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) untuk mengembangkan real-time PCR yang lebih akurat untuk mendeteksi dan identifikasi bakteri spesifik spesies Weisella koreensis dengan menggunakan sepasang primer spesies spesifik berdasarkan membran protein dari urutan genom Weisella koreensis KACC15510 yang telah dirancang.
Membran khusus yang terdapat pada bakteri pada penelitian sebelumnya ternyata dapat menunjukkan atau melakukan fungsi khusus yang berbeda dibandingkan pada bakteri yang lainnya. Perbedaan tersebut didasari pada membran khusus maupun membran sitoplasmik yang dapat berperan dalam transport membran, aktivitas mitokondria, dan fungsi biosintetis lain yang lebih krusial. Adanya penggabungan membran protein hanya dapat ditemukan pada sel prokariotik dengan fungsi yang terkait dengan sistem transportasi baik pada bakteri Gram positif maupun negatif. Protein-protein yang dimaksud tersebut merupakan subunit fungsional dari komponen transporter yang menunjukkan adanya perbedaan fungsi fisiologis dalam bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Membran protein pada bakteri memiliki perbedaan dalam hal struktur dan fungsi dan memiliki ukuran yang bervariasi namun signifikan dengan panjang residu antara 200 hingga 650 (Zgurskaya dkk, 2009).
Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan prosedur atau metode yang lebih handal dan efisien untuk deteksi kuantitatif bakteri Weisella koreensis dalam produk kimchi menggunakan SYBR Green PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode SYBR Green qPCR dapat digunakan untuk deteksi spesies spesifik serta kuantifikasi Weisella koreensis dalam berbagai produk sampel. Selain itu, pada penelitian juga telah ditemukan bahwa penambahan bumbu berupa bubuk cabai merah dapat mempengaruhi densitas dari spesies Weisella koreensis selama proses fermentasi kimchi.
BAB II
METODE
2.1 Persiapan Pembuatan Strain Bakteri, Kondisi Pertumbuhan, Preparasi DNA
Strain bacteria didapatkan dari koleksi Korean Agricultural Culture Collection (KACC) di Republik Korea dan Belgian Co-ordinated Collection of Micro-organisms (BCCMTM) . Semua strain bakteri ditumbuhkan pada media de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar pada cawan dan diinkubasi pada suhu 25 OC sampai dengan 30 OC selama 48 jam. Genom DNA diekstraksi menggunakan kit dari Qiagen (Hilden, Germany). Pengukuran kuantitas dan kemurnian genom DNA yang didapat digunakan metode NanoDrop ND-1000 spektrofotometer.
2.2 Preparasi Sampel Kimchi untuk PCR
Pengujian atau analisis kuantitatif dari sampel kimchi, digunakan 20 ml sup kimchi yang diambil secara periodic pada dua jenis kimchi. Masing-masing sup kimchi difiltrasi melalui 4 lapisan penyaring kasar yang steril untuk menghilangkan potongan besar dan selanjutnya disentrifugasi pada 13.000 rpm suhu 4 OC selama 10 menit. DNA diekstraksi menggunakan Fast DNA spin kit (MP Biomedicals, Solon, OH, USA).
2.3 Analisis Genom dan Desain Primer
Hasil sekuensing genom Weisella koreensis KACC15510 dan Bakteri Asam Laktat (BAL) lain yang diujikan diunduh dari database NCBI dan dibandingkan menggunakan pipa komputasi yang dimodifikasi (14,15). Selanjutnya hasilnya adalah gen target yang tidak memiliki kesamaan signifikan pada sekuen nukleotida pada BAL yang dipilih sebagai target PCR. Primer spesies spesifik kemudian digunakan pada gen pengkode membran protein pada Weisella koreensis KACC15510 dengan memprediksi produk PCR dari 201 bp. Primer amplifikasi untuk uji konvensional PCR dan SYBR Green qPCR selanjutnya disintesis menggunakan Bioneer Corporation (Daejon, Korea) (Tabel 3).
2.4 Konvensional PCR
Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan primer (0.2μM konsentrasi akhir) and GoTaq® Flexi DNA polymerase (1× buffer, 4.0mM MgCl2, 0.2mM pada setiap dNTP, GoTaq® DNA polymerase 1.25U konsentrasi akhir; Promega, Madison, WI, USA) dalam volume akhir 25 μl bedasarkan instruksi penggunaan primer yaitu 25 ng dari genom DNA dari strain bacteria. Amplifikasi dilakukan pada PTC-225 thermocycler dengan kondisi yang diawaili dengan denaturasi awal 5 menit pada suhu 95 OC, sebanyak 35 putaran dalam 1 menit 95 OC, 30 detik pada 61 OC, dan 1 menit pada 72 OC, selanjutnya adalan putaran akhir selama 7 menit pada suhu 72 OC. Setelah reaksi PCR tersebut, hasil selanjutnya dielektroforesis pada 1,5 % (wt/vol) gel agarose yang diwarnai menggunakan ethidium bromide (EtBr), selanjutnya diamati secara visual pada ultraviolet (UV) transilluminator dan digambarkan menggunakan sistem penggambaran VersaDoc 1000 gel (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA).
2.5 SYBR Green qPCR
Uji SYBR Green qPCR dilakukan menggunakan hasil reaksi 20 μl. Semua amplifikasi disiapkan menggunakan primer WK201F/R dengan konsentrasi akhir 0.5 μM, iQTM SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), dan 5 ng dari DNA yang telah dimurnikan pada masing-masing sampel. Amplifikasi Real-time PCR dilakukan menggunakan sistem PCR CFX96 dengan kondisi perputaran yang diawali dengan denaturasi awal selama 30 detik pada suhu 95 OC, 40 putaran selama 5 detik pada 95 OC dan 30 detik pada 61 OC dan analisis kurva titik pencairan dari 65 sampai 95 OC dengan kenaikan 0.5 OC setiap 5 detik. Penentukan Ct dan analisis data dilakukan secara otomatis menggunakan software CFX ManagerTM versi 1.6. LOQ dan deteksi batas (LOD) dari SYBR Green qPCR ditentukan menggunakan dilusi plasmid DNA, genom DNA, dan suspensi sel bakteri Weisella koreensis KACC11853 sebanyak 20 μl dengan campuran 10 μl f iQTM SYBR® Green Supermix dan 5 pM dari primer WK201F/R. LOQ dan LOD diujikan dengan metode dilusi pengenceran dan uji SYBR Green qPCR sebanyak tiga ulangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Adanya spesies spesifik pada seperangkat primer yang digunakan dirancang berdasarkan hasil sekuen dari gen membran protein dari Weisella koreensis KACC15510. Kespesifikan dari suatu primer diuji menggunakan Basic Local Alignment. Hasil dari analisis menggunakan BLAST, didapatkan bahwa hasil memiliki signifikasi dengan urutan sekuen yang telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya, kecuali pada genom DNA dari W. koreensis KACC15510. Hasil menunjukkan bahwa kekerabatan terdekat sesuai sekuen gen membran protein tersebut sam dengan Weisella confusa. Hasil dari analisis DNA PCR digunakan untuk memperkuat hasil. Hasilnya, terdapat spesifisitas sampel yang dapat divalidasi terhadap 11 spesies berbeda dari Weisella dan 13 lainnya termasuk dari strain Bakteri Asam Laktat (BAL). Selain itu, hasil uji PCR dengan target fosforilasi maltose ternyata tidak dapat digunakan untuk membedakan bakteri Weisella koreensis dengan spesies bakteri lainnya (Gambar 1).
Hasil dari penggunaan analisis SYBR Green PCR pada Weisella koreensis didapatkan data yang digunakan untuk mebuat kurva standar dengan membuat plot ambang rata-rata banding logaritma dari konsentrasi genom DNA, DNA kloning, dan kepadatan suspense sel atau densitas sel. Hasil dari analisis kurva standar pada bagian yang linear didapat koefisien sebesar -3,012 yang menghasilkan efisiensi PCR sebesar 110,1 % dan nilai pada garis Hasil dari analisis kurva standar pada bagian yang linear didapat koefisien sebesar -3,012 yang menghasilkan efisiensi PCR sebesar 110,1 % dan nilai pada garis y sebesar 31, 057 (Gambar 2b). Kurva yang menunjukkan titik melting atau leleh berasal dari plot amplifikasi yang ditunjukkan pada Gambar 2c dan analisis suhu leleh dan batas terjadinya pencairan dari Weisella koreennsis memiliki hasil suhu leleh dari 77,0 OC (Gambar 2d). Kurva standar dari genom suspense DNA dan sel bakteri disajikan dalam bentuk data korelasi linear antara nilai Ct dan konsentrasi masukan DNA (R2=0,999, kemiringan=-3,302) dan suspesni sel bakteri (R2=0,996, kemiringan=-3,414). Selain itu, analisis DNA genomic dan suspense sel bakteri menunjukkan bahwa batas deteksi SYBR green qPCR adalah 5 fg/ml yang sudah sesuai dengan 1,28 x 104 CFU/ml. Adanya penambahan cabai merah pada setiap proses fermentasi kimchi pada semua jenis kimchi yang diujikan menunjukkan adanya pengaruh yang sangat jelas terhadap densitas Weisella koreensis selama proses fermentasi kimchi, setelah terlepas dari periode suhu dan fermentasi (Gambar 3).
Penemuan adanya bakteri-bakteri pada kimchi terutama setelah proses fermentasi telah dilaporkan salah satunya adalah Weisella koreensis yang berhubungan dengan adanya produksi L-Ornithine dari arginin dan memainkan peran penting dalam pencegahan akumulasi lipid intraseluler dengan cara adanya pengaturan gen adiposit spesifik. L-Ornithine merupakan obat non protein yang memiliki potensi untuk melawan obesitas dengan cara meningkatkan pelepasan hormone dan mempercepat laju metabolisme basal (Moon, 2012).
Kimchi banyak mengandung bioaktif, namun adanya penambahan bubuk cabai merah yang mengandung capsaicin dapat meningkatkan terjadinya proses pencernaan lemak. Adanya bubuk cabai merah tersebut dapat mempengaruhi peningkatan jumlah sel mikroorganisme khususnya Weisella koreensis di dalam kimchi pada proses fermentasinya.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa uji PCR yang baru dikembangkan tersebut sudah mampu mendeteksi adanya Weisella koreensis dengan spesifisitas yang tinggi dan sensitivitas serta tanpa adanya sinyal false-positive dari Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam biakan atau kultur murni dan dalam ekstrak campuran dari DNA yang diekstraksi dari kimchi. Uji menggunakan PCR dapat digunakan sebagai metode yang berguna untuk deteksi dan kuantifikasi adanya bakteri Weisella koreensis dalam makanan dan untuk tujuan manajemen mutu pangan.
DAFTAR PUSTAKA
Kang, B. K., Cho, M. S., Ahn, T.Y., Lee, E. S. & Park, D. S. 2015. The influence of red pepper powder on the density of Weisella koreensis during kimchi fermentation. Scientific Reports.
Moon, Y. J. 2012. Intracellular lipid accumulation inhibitory effect of Weisella koreensis OK1-6 isolated from kimchi on differentiating adipocyte. J. Appl. Microbiol. 113: 652-658.
Choi, H., Kim, Y. W., Hwang, I., Kim J. & Yoon, S. 2012. Evaluation of Leuconostoc citreum HO12 dan Weisella koreensis HO20 isolated from kimchi as a starter culture for whole wheat sourdough. Food Chem. 134: 2208-2216.
Cho, K. M. 2009. Novel multiplex PCR for the detection of lactic acid bacteria during kimchi fermentation. Mol. Cell. Probes. 23: 90-94.
Zgurskaya, H. I., Yamada, Y., Tikhonova, E. B., Ge, Q. & Krishnamoorthy, G. 2009. Structural and functional diversity of bacterial membrane fusion proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1794: 794-807.
Komentar