TEKNIK STERILISASI, ASEPTIS, DAN ISOLASI MIKROBA

1.1  Latar Belakang

Mikroba merupakan organisme berukuran mikroskopis yang berarti membutuhkan alat berupa mikroskop untuk bisa mengamati strukturnya. Namun, walaupun ukurannya sangat kecil, mikroba memiliki pengaruh yang sangat besar bagi kehidupan dimana mikroba merupakan makhluk hidup tertua yang menjadi perintis seluruh kehidupan di bumi. Mikroba sendiri dapat berupa virus, archaeabacteria, bakteri, jamur, dan protozoa. Ukurannya yang sangat kecil menyebabkan tingginya diversitas jenis mikroba di bumi, hal tersebut menyebabkan kehidupan mikroba di habitatnya cenderung berada dalam populasi campuran sehingga untuk mendapatkan mikroba spesies tunggal membutuhkan suatu metode pemisahan yang sering disebut sebagai isolasi (Sutarminingsih, 2004).

Metode pemisahan atau isolasi dilakukan dengan tujuan mendapatkan isolat berupa bakteri spesies tunggal dari habitatnya dan memisahkannya dari spesies bakteri yang lain. Selain dilakukan pemisahan, bakteri spesies tunggal hasil pemisahan yang didapatkan harus diberikan perawatan ekstra agar tidak terjadi kontaminasi dengan spesies lain serta dapat bertahan hidup dan berkembang biak dengan baik. Perawatan ekstra tersebut dapat dilakukan dengan metode pemeliharaan kultur spesies tunggal atau biasa disebut kultur murni. Namun, sebelum dilakukan pemeliharaan, isolat yang didapatkan harus dimurnikan terlebih dahulu agar terbebas dari kontamina (Sutarminingsih, 2004).

Bakteri yang telah dimurnikan memiliki banyak fungsi dalam penelitian tentang mikrobiologi, salah satu fungsinya adalah untuk identifikasi morfologi dan fisiologis suatu spesies bakteri (Pelczar, 2001).  Berdasarkan latar belakang tersebut maka dapat diketahui bahwa mengisolasi, memurnikan, dan melakukan pemeliharaan terhadap bakteri spesies tunggal sangat bermanfaat untuk bahan dasar identifikasi bakteri. Oleh karena itu, praktikum ini penting dilakukan untuk dapat melakukan isolasi, pemurnian, dan pemeliharaan mikroba untuk identifikasi morfologi dan fisiologis suatu spesies mikroba. Selain itu, praktikum ini juga bertujuan untuk dapat melakukan perhitungan angka lempeng total (Total Plate Count).

1.2  Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini antara lain:

1.      Bagaimana cara isolasi spesies tunggal mikroba dari suatu lingkungan  serta pemurniannya ?

2.      Bagaimana teknik penyimpanan kultur murni suatu jenis mikroba ?

3.      Bagaimana cara mengkarakterisasi pertumbuhan koloni murni hasil dari isolasi?

1.3  Tujuan

Tujuan pada praktikum ini antara lain:

1.      Mengetahui cara isolasi spesies tunggal mikroba dari suatu lingkungan serta memurnikannya.

2.      Mengetahui cara melakukan penyimpanan kultur murni suatu jenis mikroba dengan baik dan benar.

3.      Mengetahui cara mengkarakterisasi pertumbuhan koloni murni hasil dari isolasi.

1.4  Manfaat

Hasil praktikum ini dapat dimanfaatkan sebagai bahan dasar kepentingan identifikasi morfologi dan fisiologis dari suatu spesies mikroba dari suatu lingkungan. Hasil juga dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan fermentasi untuk produk makanan dan minuman. Selain itu, apabila bakteri yang dibiakkan untuk mengurangi pencemaran lingkungan dari detergen atau minyak, maka hasil dapat digunakan untuk kepentingan bioremidiasi.

2.1 Mikroba

Mikroba merupakan makhluk hidup berukuran mikroskopis yang terdiri dari virus, archaeabacteria, bakteri, fungi, dan protozoa.  Walaupun ukuran tubuhnya sangat kecil, mikroba mempunyai kemampuan adaptif yang sangat baik sehingga tingkat keberhasilannya untuk bertahan hidup sangat tinggi. Mikroba juga mempunyai kelebihan dalam proses perkembangbiakannya yang sangat cepat dan hanya membutuhkan waktu singkat yaitu dalam hitungan menit (Muliawan, 2007).

Bakteri merupakan mikroba bersel tunggal yang berkembang biak dengan cara pembelahan biner. Berdasarkan kebutuhan akan oksigennya, bakteri dikelompokkan dalam dua macam yaitu bakteri aerob dan bakteri anaerob. Bakteri aerob merupakan jenis bakteri yang membutuhkan oksigen dengan konsentrasi tinggi untuk proses respirasi dan metabolismenya. Sementara itu, bakteri anaerob merupakan jenis bakteri yang hanya membutuhkan konsentrasi oksigen yang cukup rendah untuk pertumbuhannya, dimana oksigen yang terlalu banyak menjadi zat beracun bagi bakteri jenis anaerob (Muliawan, 2007).

Bakteri memiliki kemampuan adaptif yang tinggi dan seringkali melakukan mutasi terhadap dirinya sendiri untuk melakukan adaptasi terhadap perubahan di lingkungannya. Selain berdasarkan kebutuhan akan oksigen, bakteri juga dikelompokkan berdasarkan temperatur lingkungannya karena temperatur lingkungan dapat mempengaruhi sekresi enzim yang mengatur pertumbuhan mikroba. Berdasarkan temperaturnya, bakteri dikelompokkan dalam psikrofil, mesofil, dan termofil. Psikrofil merupakan bakteri yang bertahan pada suhu minimum, mesofil pada suhu optimum, dan termofil pada suhu maksimum (Suharni, 2009).

2.2 Isolasi Bakteri dengan Teknik Dilusi (Pengenceran)

Isolasi bakteri merupakan proses pemisahan bakteri spesies tunggal dari kontamina atau spesies yang lain di lingkungan yang sama. Isolasi bakteri yang umum dilakukan adalah dengan menggunakan teknik dilusi. Teknik dilusi atau pengenceran dimaksudkan untuk mengisolasi sel tunggal sekaligus mengurangi atau mereduksi jumlah sel bakteri yang sangat banyak sehingga dapat dihitung dengan mudah pada proses perhitungan seperti Total Plate Count. Namun, teknik dilusi membutuhkan perhitungan dengam membandingkan volume sampel dengan total volume sampel dengan diluent yang berupa H₂O (Varma dan Kharkwal, 2009).

Teknik dilusi menggunakan tabung reaksi yang biasanya digunakan secara berseri sesuai kebutuhan pengencerannya. Alat-alat yang digunakan harus dalam keadaan steril. Perhitungan koloni hasil dari teknik dilusi berseri dapat menentukan jumlah sel bakteri tersebut pada media hasil dilusinya (Varma dan Kharkwal, 2009).

2.3 Teknik Isolasi Koloni Murni

Isolasi bakteri ke dalam bentuk murni merupakan cara terbaik untuk mempelajari karakteristik dari kultur bakteri. Hal tersebut biasanya dilakukan dengan cara menyebarkan sampel berisi mikroba dalam medium padatan sehingga sel tunggalnya dapat berkembang biak di permukaan agar. Pada umumnya, teknik isolasi koloni murni bakteri dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu streak plating, spread plating, dan pour plating (Tabo, 2004).

2.3.1 Pour Plate Technique

Teknik isolasi secara pour plate dilakukan dengan cara sebuah media dituangkan ke dalam plate atau cawan petri dengan sebuah inoculum dan membiarkannya agar memadat. Penggunaan teknik ini dapat mengisolasi mikroba anaerob. Campuran populasi bakteri terlebih dahulu dilakukan pengenceran dalam Nutrient Agar. Selanjutnya media dituangkan dalam petri steril untuk diinkubasi  supaya media memadat dan bakteri dapat mulai berkembang biak. Setelah proses inkubasi, koloni bakteri akan tumbuh di permukaan media (Pommerville, 2010).

2.3.2 Streak Plate Technique

Teknik isolasi ini cukup menggunakan bakteri sebanyak ujung melingkar jarum ose yang disebarkan di atas permukaan media agar yang telah memadat, teknik penyebaran menggunakan ujung jarum ose tersebut disebut dengan teknik streak. Ujung jarum ose sebelum dan sesudah digunakan harus dibakar dengan api dengan tujuan membunuh bakteri dan memperkecil kontaminasi. Streak dilakukan setiap quarter petri dimana dibagi menjadi 4 kuadran yang berbeda yang sebelumnya telah dibagi-bagi. Teknik ini baik digunakan untuk mengisolasi bakteri dalam jumlah yang besar saja (Sumbali dan Mehrotra, 2009).

2.3.3 Spread Plate Technique

Teknik isolasi ini dilakukan dengan cara mengambil sedikit volume sampel yang telah dilakukan pengenceran dan memasukkannya ke dalam bagian tengah permukaan media agar. Selanjutnya, inokulasi dilakukan secara menyebar dengan menggunakan batang gelas dengan ujung membungkuk yang steril. Penyebaran tersebut harus dilakukan dalam lokasi titik yang berbeda dalam satu cawan petri yang sama. Setelah proses inokulasi tersebut, cawan di inkubasi sehingga sel bakteri mulai berkembang biak dan membentuk koloni (Mehrorta, 2009).

2.3.4 Metode Isolasi Lain

Selain tiga teknik yang biasanya digunakan tersebut, masih banyak teknik isolasi bakteri lain seperti drop plating, agar droplet, spiral plating. Pada drop plating, media yang digunakan berupa padatan, caranya adalah dengan menggunakan pipet berisi 0.02 ml per tetes dan dibuat 5 tetesan di atas permukaan cawan secara terpisah, dimana setiap tetesan akan mengering sebelum inkubasi. Agar droplet merupakan teknik paling sederhana dimana hasil dilusi dimasukkan dalam agar (0-1ml), selanjutnya koloni bakteri akan terbentuk di droplet yang memadat selama inkubasi. Sementara itu teknik spiral plating menggunakan mesin pemutar yang memutar agar dalam cawan sehingga sampel terus berkurang dari tengah ke tepi selama proses memutar, sementara koloni bakteri akan terbentuk di jalur pemutaran (spiral) selama inkubasi (Yousef dan Carlstrom, 2003).

2.4 Teknik Penyimpanan Kultur Murni

Teknik penyimpanan kultur murni bakteri perlu diperhatikan agar kultur murni tetap terjaga kemurniannya, jauh dari kontamina, dan strukturnya tidak rusak ataupun mengalami mutasi. Penyimpanan kultur murni dimaksudkan untuk penelitian selanjutnya di masa yang akan datang. Teknik penyimpanan yang paling sederhana adalah dengan cara mentransfer bakteri ke media dengan kondisi nutrisi yang sangat minimal agar bakteri tidak terjadi ledakan populasi bakteri, selain itu hal yang perlu diperhatikan adalah kultur harus diberikan label yang tahan lama agar mempermudah proses identifikasi (Pitt dan Hocking, 2009).

2.4.1 Agar Slants

Teknik penyimpanan kultur murni berdasarkan lama bertahannya dibagi menjadi dua yaitu jangka pendek dan jangka panjang. Pada jangka pendek, umumnya penyimpanan dilakukan pada media agar slants atau agar miring. Proses inokulasi dari cawan petri ke media agar miring pada tabung reaksi dapat dilakukan dengan menggunakan ujung jarum ose steril (Estridge dan Reynolds, 2011).

2.4.2 Lyophilization or Freezed-drying

Teknik penyimpanan dengan kering beku merupakan teknik penyimpanan kultur yang dapat bertahan dalam jangka waktu yang panjang. Media yang biasanya digunakan adalah media broth dengan gliserol. Penambahan gliserol pada media bertujuan untuk melakukan pengawetan melalui proses pengeringan pada sel bakteri. Air dari suspensi bakteri yang dibekukan dihilangkan dengan cara sublimasi menggunakan vacuum (Estridge dan Reynolds, 2011).

2.4.3 Kriopreservasi

Kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan dengan jangka waktu yang panjang. Salah satunya adalah menyimpan kultur pada lemari es dengan suhu yang sangat rendah sehingga bakteri dalam kultur melakukan dorman atu menonaktivkan metabolismenya. Namun, kultur yang sedang dorman dapat dihidupkan kembali di media yang banyak mengandung nutrisi. Selain menggunakan lemari es, penyimpanan pada nitrogen cair yang suhunya sangat rendah dapat dijadikan teknik kriopreservasi yang baik untuk kultur, namun harganya sangat mahal (Andersen, 2005).

2.5 Karakterisasi Koloni Bakteri

Karakterisasi koloni bakteri merupakan pengetahuan tentang mengenal karakter suatu koloni bakteri untuk proses identifikasi bakteri. Pada umumnya, karakterisasi koloni bakteri ini dapat dilihat dari tiga hal yaitu bentuk keseluruhan, dari sudut elevasi, dan bentuk tepiannya. Koloni bakteri sendiri merupakan kumpulan bakteri yang akan terbentuk ketika sel bakteri diinokulasikan ke media padatan seperti agar (Pommerville, 2010).

2.6 Total Plate Count (TPC)

      Teknik perhitungan sel bakteri dengan cara menghitung banyak koloni yang terbentuk dalam satu cawan petri berisi dengan bagian hasil pengenceran berseri biasa disebut dengan teknik Total Plate Count. Teknik perhitungan ini dapat dimulai setelah proses inkubasi minimum (bakteri 24 jam dan fungi 3x24 jam) telah dilakukan. Perhitungan dilakukan dengan memperhatikan setiap titik bergantung ukuran dan warnanya sebagai 1 koloni, perhitungan tersebut lebih baik dilkakun dengan menggunakan alat bantu kaca pembesar. Setiap hasil rasio dilusi, dihitung minimal 5 sampel dalam cawan baik untuk bakteri maupun fungi. Hasil perhitungan jumlah koloni yang dimisalkan n dicatat masing-masing untuk bakteri dan fungi sendiri. Dari 5 sampel pada cawan yang telah dihitung, dihitung nilai rata-ratanya , dan kemudian dihitung angka total koloni dengan rumus (Jordano, 2002):

4.1.3 Faktor Lingkungan yang Mempengaruhi Pertumbuhan

         Bakteri

      Sel bakteri memiliki kemampuan untuk tumbuh dalam waktu yang cepat dan membentuk sebuah kumpulan yang disebut sebagai koloni. Setiap koloni dianggap berasal dari satu sel tunggal sehingga bersifat identik setiap selnya. Pertumbuhan koloni bakteri merupakan hasil dari interaksi yang terjadi antara kapasitas pertumbuhan sel dengan lingkungan dimana  pertumbuhan tersebut terjadi, faktor lingkungan yang dimaksud tersebut antara lain (Srivastava dan Srivastava, 2003):

1.      Konsentrasi nutrisi, semakin banyak nutrisi yang tersedia, maka pertumbuhan bakteri semakin meningkat hingga sampai pada ketersediaan nutrisi tersebut sangat terbatas atau habis, bakteri akan berhenti tumbuh. Pada beberapa bakteri akan membentuk endospora dalam keadaan kekurangan nutrisi, sementara yang tidak bisa membentuk spora akan perlahan mati.

2.      Suhu, setiap spesies bakteri memiliki suhu pertumbuhan optimal yang spesifik. Bakteri kelompok archaeabacteria memiliki kemampuan hidup di tempat bersuhu sangat rendah atau sangat tinggi. Sementara bakteri biasa memiliki suhu pertumbuhan optimal mendekati suhu ruang.

3.      Aktivitas air, air merupakan pelarut umum yang banyak digunakan untuk reaksi biokimiawi, jumlah dari air bebas yang tersedia untuk digunakan dalam suatu reaksi biasa disebut dengan aktivitas air yang nilainya ekuivalen dengan kelembaban relatif. Pada umumnya bakteri membutuhkan aktivitas air dengan nilai 0.9 untuk proses metabolisme optimal yang menunjang pertumbuhannya.

4.      Tekanan, tekanan yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah tekanan osmosis dan hidrostatis. Tekanan osmosis dipengaruhi oleh konsentrasi zat terlarut dalam air. Sementara tekanan hidrostatis tersebut dari jumlah atau banyaknya molekul air.

5.      Keasaman dan pH, pH dapat mempengaruhi proses perubahan protein bakteri yang dapat merubah bentuk dan aktivitas dari protein selnya. pH yang sangat rendah dan sangat tinggi merupakan inhibitor pertumbuhan bakteri.

6.      Cahaya, fungsi dari cahaya adalah untuk kebutuhan bakteri yang dapat melakukan fotosintesis untuk fotoautotropis menghasilkan ATP. Namun, cahaya jenis cahaya tampak dan cahaya ultraviolet dapat merusak sel bakteri, sehingga bakteri tersebut melindungi dirinya dengan cara sintesis karoten atau pigmen lain yang dapat mengabsorbsi cahaya dengan panjang gelombang tertentu.

4.1.4 Streptomycin

      Streptomycin merupakan obat antibiotic yang memiliki fungsi sama dengan aminoglycosides yang berfungsi sebagai bakterisida. Cara kerja antibiotic ini adalah mengganggu proses sintesis protein bakteri. Streptomycin juga dapat berfungsi sebagai antibiotic yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri jenis gram negatif. Namun, Streptomycin ini masih tergolong sebagai bakterisida yang tidak terlalu efektif untuk dijadikan antibiotik bakteri yang sangat resisten (Madkour, 2014).  

4.1.5 Aplikasi Teknik Isolasi Mikroba dalam Industri

      Teknik isolasi mikroba khususnya bakteri dilakukan dengan tujuan memisahkan satu spesies bakteri dari bakteri spesies lain yang hidup pada lingkungan yang sama untuk dapat dimurnikan dan dibiakkan. Teknik isolasi bakteri biasanya digunakan untuk mengisolasi bakteri yang dapat diambil manfaatnya pada bidang industri dan memiliki nilai ekonomis. Namun, isolasi bakteri jenis gram negatif yang cenderung pathogen juga seringkali dilakukan isolasi dengan tujuan yang beragam seperti bioremidiasi. Berikut adalah beberapa contoh hasil isolasi bakteri yang berguna dalam bidang industri (Chen, 2009):

1.      Produksi PHB yang digunakan untuk pembuatan cangkir, botol, dan syringe menggunakan Alcaligenes latus.

2.      Produksi PHBV yang digunakan sebagai bahan pembuatan botol shampo menggunakan R. eutropha.

DAFTAR PUSTAKA

Andersen, Robert A. 2005. Algal Culturing Techniques. Academic

            Press: London.

Chen, George Guo-Qiang. 2009. Plastics from Bacteria: Natural

            Function and Applications. Springer Science & Business

            Media: New York.

Corry, J. E. L., G. D. W. Curtis, dan R. M. Baird. 2012. Handbook of

            Culture Media for Food and Water Microbiology. The Royal

            Society of Chemistry: Cambridge, UK.

Estridge, Barbara., dan Anna Reynolds. 2011. Basic Clinical Laboratory

            Techniques. Cengage Learning: USA

James, Joyce, Colin Baker, dan Helen Swain. 2002. Prinsip – prinsip

            Sains untuk Keperawatan. Penerjemah, Wardhani. Erlangga:

            Jakarta.

Jordano, R. 2002. Comparison of Petrifilm Method to Conventional

            Methods for Enumerating Aerobic Bacteria, Coliforms,

            Escerichia coli and Yeasts and Moulds. Foods Acta Mircobiol

            Immunol Hung. 42(3): 255-259.

Madkour, M. Monir. 2014. Brucellosis. Cambridge University Press:

            Great Britain.

Sumbali, G., dan R. S. Mehrotra. 2009. Principles of Microbiology. Tata

            McGraw Hill Education Private Limited: New Delhi

Muliawan, Sylvia Y. 2007. Bakteri Anaerob yang Erat Kaitannya

            dengan Problem di Klinik. EGC: Jakarta.

Pelczar. 2001. Microbiology: Application Based Approach. Tata

            McGraw Hill: New Delhi

Pitt, John I., dan Ailsa D. Hocking. 2009. Fungi and Food Spoilage.

            Springer Science & Business Media: London, New York.

Pommerville,  Jeffrey C. 2010. Alcamo’s Laboratory Fundamentals of

            Microbiology. Jones &  Bartlett Learning Canada: Ontario,

            Canada.

Sastri, Varun. 2006. Microbes. Isha Books: India

Srivastava, Sheela., dan P. S. Srivastava. 2003. Understanding Bacteria.

            Kluwer Academic Publishers: The Netherlands

Suharni, Theresia T. 2008. Mikrobiologi Umum. Penerbit Universitas

            Atma Jaya: Yogyakarta

Sutarminingsih, L. 2004. Peluang Usaha Nata de Coco. Kanisius:

            Yogyakarta

Tabo, N. 2004. Laboratory Manual in Microbiology. Rex Book Store,

            Inc.: Manila.

Varma, A., dan Amit C. Kharkwa. 2009. Symbiotic Fungi: Principles

            and Practice. Springer-Verlag  Berlin Heidelberg: London, New

            York.

Werkman, C. H., dan P. W. Wilson. 2013. Bacterial Physiology.

            Academic Press: New York.

Yousef, Ahmed E., dan Carolyn Carlstrom. 2003. Food Microbiology: A

            Laboratory Manual. John Wiley & Sons, Inc.: New Jersey.