1.1 Latar Belakang
Mikroba memiliki bentuk sel yang sangat bervariasi, variasi tersebut dapat dipengaruhi oleh faktor – faktor lingkungan tempat hidupnya. Ukuran mikroba sangat kecil atau mikroskopis sehingga membutuhkan alat bantu untuk mengamati bentuk dan struktur selnya terutama mikroba yang tergolong dalam bakteri, alat bantu tersebut adalah mikroskop. Walaupun banyak variasi dari bentuk sel bakteri, pada umumnya bentuk sel tersebut dikelompokkan menjadi tiga yaitu bulat (kokus), batang (basilus), dan heliks (spiral/spirilla) (Campbell dkk., 2003).
Pengelompokkan bakteri berdasarkan bentuk selnya merupakan salah satu cara untuk identifikasi suatu spesies bakteri dilihat dari morfologinya. Namun, indeks bias yang dimiliki oleh sel bakteri dengan indeks bias lingkungannya tidak jauh berbeda sehingga untuk mengamati morfologi bakteri tidak mudah dilakukan walaupun bakteri akan diamati di atas gelas obyek menggunakan mikroskop, hal tersebut disebabkan indeks bias sel bakteri juga hampir sama dengan indeks bias kaca yang digunakan sebagai gelas obyek. Selain itu, identifikasi bakteri juga dapat dilakukan dengan cara staining atau pewarnaa yaitu pewarnaan gram (komposisi dinding sel) dan endospora, selain itu juga dibutuhkan pewarnaan pada fungi untuk mempermudah pengamatan koloni fungi. Berdasarkan komposisi penyusun dinding selnya, bakteri dikelompokkan menjadi bakteri gram positif dan gram negatif (Yuwono, 2001).
Pewarnaan endospora dilakukan untuk mengetahui fase suatu bakteri atau bakteri yang dapat membentuk spora dan tidak. Sementara itu, pewarnaan gram berdasarkan perbedaan komposisi penyusun dinding sel pada bakteri berfungsi sebagai pengatur dan pelindung sel terhadap tekanan osmotik dan mekanik (Yuwono, 2001). Praktikum ini penting dilakukan untuk dapat melakukan identifikasi bakteri secara morfologi bentuk selnya, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada praktikum ini antara lain:
1. Bagaimana struktur morfologi bakteri ?
2. Bagaimana teknik pembuatan sediaan apusan bakteri ?
3. Bagaimana cara menggunakan teknik pewarnaan gram pada bakteri sesuai prinsip pewarnaan tersebut?
4. Bagaimana cara menggunakan teknik pewarnaan endospora?
5. Bagaimana cara melakukan uji gram menggunakan KOH pada bakteri?
1.3 Tujuan
Tujuan pada praktikum ini antara lain:
1. Mengetahui struktur morfologi bakteri.
2. Mengetahui teknik pembuatan sediaan apusan bakteri.
3. Mengetahui cara menggunakan teknik pewarnaan gram pada bakteri beserta prinsipnya.
4. Mengetahui teknik pewarnaan endospora.
5. Mengetahui teknik uji gram menggunakan KOH pada bakteri.
1.4 Manfaat
Hasil dari praktikum ini dapat bermanfaat untuk menambah ilmu terapan dalam identifikasi mikroba khususnya bakteri dan fungi dengan menggunakan teknik pewarnaan gram, endospora, maupun pewarnaan fungi. Selain itu, hasil praktikum apabila memungkinkan dapat digunakan untuk menghasilkan spesies temuan baru sehingga menambah diversitas mikroba pada lingkungan lokasi sampling. Apabila mikroba yang teridentifikasi merupakan mikroba yang menguntungkan maka dapat dibiakkan dalam media untuk menambah bank kultur mikroba di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya.
2.1 Bentuk Sel Bakteri
Bakteri memiliki bentuk sel yang beragam setiap jenisnya, bentuk sel tersebut biasanya dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan tempat hidup bakteri sehingga bakteri tersebut dapat tetap melangsungkan hidupnya. Hal tersebut menunjukkan bahwa mengetahui berbagai macam bentuk sel bakteri itu sangat penting dilakukan untuk dapat mengidentifikasi suatu spesies bakteri berdasarkan bentuk atau morfologinya. Penentuan bentuk sel bakteri untuk keperluan identifikasi dapat dilakukan melalui pengamatan di bawah mikroskop (Campbell dkk., 2003).
Bakteri memiliki struktur sel dasar yang sama. Namun, bentuk dari bakteri secara morfologi bermacam-macam. Terdapat 5 macam bentuk morfologi bakteri walaupun sebelumnya telah disebutkan terdapat 3 yang paling umum yaitu batang, bulat, dan spiral. Dua bentuk morfologi bakteri lainnya adalah vibrios dan spirochaetas (Cheesbrough, 2006).
2.1.1 Bakteri Berbentuk Bulat (Cocci)
Bentuk morfologi bakteri jenis ini cenderung berbentuk membulat atau oval pada selnya. Ukuran sel sebesar 0,5 – 1, 0 µm. Ketika melakukan pembelahan, bakteri jenis ini akan membentuk pasangan, rantai, atau grup. Bakteri berbentuk bulat yang membentuk pasangan tersebut dikelompokkan lagi menjadi (Cheesbrough, 2006):
1. Diplococci, yaitu bakteri berbentuk bulat dengan sel berjumlah sepasang. Contohnya, gonococci.
2. Streptococci, bakteri membentuk rantai. Contohnya, Streptococcus pyogenes.
Staphylococci, bakteri membentuk suatu grup yang menyerupai buah anggur.
2.1.2 Bakteri Berbentuk Batang (Bacilli)
Bakteri yang termasuk dalam bakteri bacilli memiliki bentuk seperti tongkat atau batang dengan ujung melingkar, fusiform, atau segi empat. Ukuran bakteri ini 1 - 10 µm panjangnya, dan 0,3 – 1,0 µm lebarnya. Bakteri yang berbentuk batang pendek dengan ujung melingkar biasanya disebut coccobacilli. Sementara itu, apabila terjadi pembelahan, bakteri jenis ini jarang berhubungan satu sama lain tetapi cenderung memisah. Walaupun cenderung saling memisahkan diri, biasanya bakteri jenis ini juga dapat saling berhubungan seperti (Cheesbrough, 2006):
1. Membentuk rantai tunggal, contohnya Streptobacillus sp.
2. Membentuk rantai bercabang, contohnya Lactobacillus sp.
3. Membentuk sekumpulan, contohnya Mycobacterium leprae.
2.1.3 Bakteri Berbentuk Spiral, Vibrios, dan Spirochaetes
Bakteri berbentuk spiral memiliki ukuran tubuh dengan panjang 3 - 4 µm dan 1 µm lebar. Bakteri jenis ini bergerak dengan sekumpulan flagella di kedua ujung selnya, contohnya adalah Spirillum minus. Sementara itu bakteri yang termasuk jenis vibrios memiliki bentuk batang bengkok berukuran 3 – 4 µm panjangnya dan lebarnya 0,5 µm. Pergerakannya dibantu dengan flagella tunggal di salah satu ujung selnya. Walaupun begitu, bakteri jenis ini memiliki pergerakan yang sangat cepat, contohnya Vibrio cholera (Cheesbrough, 2006).
Bakteri yang termasuk dalam spirochaetes memiliki tubuh yang fleksibel dan aktif bergerak. Kebanyakan spesies ini memiliki pergerakan yang lincah dan tidak mudah diberikan pewarnaan gram. Spirochaetes dibagi dalam 3 kelompok utama (Cheesbrough, 2006).
1. Treponemes, termasuk spesies yang berukuran paling kecil dalam kelompok spirochaetes. Ukuranya sebesar 6 – 15 µm panjang dan 0,2 µm lebar. Contohnya Treponema pallidum.
2. Borreliae, termasuk kelompok spirocheates yang berukuran besar. Ukurannya berkisar 10 – 20 µm panjangnya, dan 0,5 µm lebarnya. Contohnya Borrelia duttoni.
3
2.2 Bakteri Gram Negatif dan Gram Positif
Semua bakteri memiliki dinding sel yang mengandung polysaccharide dan protein yang biasa disebut dengan peptidoglikan. Peptidoglikan fungsinya adalah untuk memberikan kekuatan dan kekokohan atau rigiditas dinding sel pada bakteri. Bakteri berdasarkan komposisi penyusun dinding selnya dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal, sementara bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang sangat tipis (Weeks dan Alcamo, 2008).
Lapisan peptidoglikan yang sangat tebal menyebabkan bakteri gram positif tidak mudah mengalami transportasi larutan atau pertukaran larutan terutama pencucian menggunakan alcohol pada saat proses pewarnaan gram. Pada bakteri gram negatif, terdapat bagian yang membatasi dinding sel dengan membrane sel yang disebut sebagai ruang periplasma yang terisi dengan periplasm. Sintesis peptidoglikan dan enzim-enzim yang dimiliki bakteri gram negatif terjadi di ruang periplasma sehingga perannya sangat penting (Weeks dan Alcamo, 2008). Teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi suatu spesies bakteri termasuk dalam golongan gram negatif atau gram positif dapat dilakukan dengan cara pewarnaan gram yang sangat sederhana (Weeks dan Alcamo, 2008).
2.3 Endospora
Bakteri memiliki kemampuan adaptif untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya yang sangat tinggi. Hal tersebut membuat spesies bakteri jauh dari ancaman kepunahan. Beberapa jenis bakteri tertentu khususnya pada kelompok Bacillus dan Clostridium memiliki kemampuan untuk memproduksi endospora yang dapat membuat bakteri tersebut menjadi sangat kuat dan sangat resisten terhadap suatu apapun (Weeks dan Alcamo, 2008).
Struktur endospora umumnya dikenal sebagai spora yang merupakan bentuk untuk istirahat bakteri selama siklus hidupnya berlangsung. Bakteri akan membentuk spora pada keadaan tertentu seperti stres akibat kurangnya ketersediaan nutrisi maupun faktor lingkungan lainnya. Endospora terdiri dari kromosom, dua sel membran, sebuah korteks, mantel spora, dan exosporium yang mengelilingi dinding sel. Spora tersebut dapat melindungi bakteri dengan menjadikan bakteri tersebut berisitirahat (dorman), bakteri yang membentuk spora dapat bertahan hidup selama bertahun-tahun walaupun lingkungannya tidak mendukung untuk kehidupan bakteri tersebut (Weeks dan Alcamo, 2008).
2.5.1 Pewarnaan Endospora
Proses pewarnaan endospora bertujuan untuk mengetahui suatu spesies tersebut dapat membentuk spora atau tidak, atau untuk mengetahui ada tidaknya spora pada suatu spesies bakteri. Proses pewarnaan endospora tidak sederhana seperti pewarnaan gram, namun lebih kompleks. Hal tersebut disebabkan karena pewarna tidak bisa melakukan penetrasi terhadap dinding endospora dimana sekali diwarnai, maka tidak akan terjadi proses pencucian penghilangan warnanya (Sumbali dan Mehrotra, 2009).
Pewarnaan endospora biasanya dilakukan dengan pewarnaan Schaeffer – Fulton. Teknik pewarnaan ini menggunakan pewarna utama malachite green yang langsung diaplikasikan pada preparat smear yang telah dipanaskan dan kemudian memanaskannya kembali selama 5 menit. Panas yang diberikan memiliki fungsi untuk membantu zat pewarna melakukan penetrasi ke dalam mantel spora yang tidak permeabel. Selanjutnya preparat dicuci dengan air selama 30 detik sehingga zat pewarna yang menempel di bagian sel lain selain endospora hilang tercuci bersih. Selanjutnya, diberikan pewarna safranin ke preparat smear untuk mewarnai bagian sel lain selain endospora sehingga hasil akhirnya adalah endospora berwarna hijau dan bagian sel lain berwarna merah atau merah muda untuk dapat membedakan bagian endospora dan sel vegetatifnya (Sumbali dan Mehrotra, 2009).
4.1.3 Kelebihan dan Kekurangan Pewarnaan Gram
Pewarnaan bakteri dengan menggunakan pewarnaan gram dapat digunakan untuk pengamatan secara langsung direct visualization. Kelebihan dari penggunaan teknik pewarnaan ini adalah biaya yang murah tetapi waktu yang dibutuhkan sangat cepat. Teknik ini bisa digunakan untuk mendiagnosis adanya suatu penyakit akibat dari bakteri gram negatif contohnya gonorrhea (Tan dkk., 2008).
Pewarnaan gram juga memiliki kelebihan dan berguna untuk mengamati struktur, bentuk, dan karakteristik sel bakteri. Hal tersebut mempermudah identifikasi suatu spesies bakteri. Sementara itu, kekurangan dari pewarnaan gram adalah tidak dapat digunakan untuk melihat isi atau organel – organel yang ada di dalam sel bakteri (McVey dkk., 2013).
4.1.4 Metode Pewarnaan selain Pewarnaan Gram
Metode pewarnaan lain selain menggunakan pewarnaan gram pada bakteri antara lain adalah acid – fast, flagella staining, nuclear staining, dan metachromatic staining. Pewarnaan menggunakan teknik acid – fast digunakan untuk mewarnai sel mikroba yang memiliki dinding sel dengan kandungan lemak sehingga dindingnya bersifat hidrofobik. Bakteri acid – fast tidak biasanya bersifat resisten terhadap larutan asam dan alkaline, contohnya adalah bakteri jenis Mycobacterium leprae. Pewarna yang digunakan adalah carbolfuchsin, bakteri jenis acid – fast akan terwarnai enjadi warna merah selnya karena pewarna carbolfuchsin akan larut dengan komposisi penyusun dinding selnya (Sumbali dan Mehrotra, 2009).
Pewarnaan flagella digunakan untuk mengetahui bentuk flagella yang dimiliki bakteri menggunakan mikroskop cahaya dengan cara ketebalan flagella bakteri dipertebal dengan melapisinya menggunakan mordants (tannic acid dan potassium alum) yang selanjutnya dilakukan pewarnaan menggunakan pewarna pararosaniline (Metode Leifson) atau pewarna fuchsin dasar (Metode Gray). Pewarnaan inti (nuclear) untuk mengamati materi di dalam nukleus yaitu molekul DNA sirkuler tunggal dan membedakan membran inti. Pewarnaan inti membutuhkan proses hidrolisis terlebih dahulu menggunakan hydrochloric acid terhadap sitoplasma selnya yang kemudian dilakukan pewarnaan menggunakan pewarna giemsa yang memberikan warna ungu pada badan inti (Sumbali dan Mehrotra, 2009).
4.1.5 Endospora hanya ada di Bakteri Gram Positif dengan Bentuk
Sel Batang
Bakteri dengan sel berbentuk batang dan termasuk dalam bakteri gram positif merupakan tipe bakteri yang hampir semuanya dapat memproduksi endospora untuk tetap bertahan hidup pada lingkungan yang tidak menguntungkan. Hal tersebut dapat terjadi karena faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internalnya, dilihat dari komposisi dinding sel bakteri gram positif yang memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal menyebabkan bakteri tersebut dapat hidup di tempat yang ekstrim tidak seperti bakteri gram negatif, selain itu struktur sel berbentuk batang pada bakteri gram positif memiliki struktur yang mirip dengan endospora sehingga dapat terjadi sporulasi yaitu proses pembentukan endospora (Madigan dkk., 2012 ).
Bakteri dengan gram positif berbentuk batang yang memiliki endospora pada umumnya dikelompokkan menjadi dua yaitu Bacillus yang bersifat aerobik dan Clostridium yang mengandung spesies fermentatif. Faktor eksternal yang mendukung bahwa endospora dapat diproduksi oleh bakteri jenis tersebut adalah bahwa secara ekologi, karena habitat bakteri gram positif berbentuk batang pada Bacillus dan Clostridium tersebut secara alami adalah di dalam tanah dimana hidupnya sebagai saprofit organisme tanah, hal tersebut menyebabkan kemampuan untuk memproduksi endospora akan sangat menguntungkan bagi bakteri yang habitatnya di dalam tanah karena tanah merupakan lingkungan yang memiliki tingkat nutrisi, suhu, dan aktivitas air yang dapat mengalami perubahan tingkatannya dalam waktu yang cepat, sehingga bakteri tanah bisa memproduksi endospora sebagai sifat adaptasi terhadap habitatnya agar tetap bisa melangsungkan kehidupannya (Madigan dkk., 2012).
4.1.6 Faktor – faktor terbentuknya Endospora
Bakteri yang dapat membentuk endospora hanya terdapat pada jenis bakteri tertentu misal Bacillus dan Clostridium. Endospora merupakan bentuk sel yang mengalami keadaan istirahat atau dorman yang dapat bertahan dalam waktu yang sangat lama hingga berjuta tahun. Endospora sangat resisten terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan misal suhu yang terlalu tinggi, irradiasi, asam kuat, disinfektan, dan lainnya. Endospora tersebut dibentuk oleh sel vegetatif bakteri sebagai tanggapan terhadap sinyal dari lingkungan yang mengindikasikan faktor pembatas untuk pertumbuhan sel vegetatif seperti kekurangan nutrisi esensial (Maheswari, 2008).
Endospora pada bakteri gram positif dengan bentuk sel basil dapat dikelompokkan berdasarkan letak endosporanya. Menurut letak endosporanya, endospora dikelompokkan atas endospora terminal, endospora subterminal, dan endospora central. Endospora terminal menunjukkan letak endospora di bagian ujung sel vegetatif, endospora subterminal menunjukkan letak endospora antara ujung dan tengah dari sel vegetatif, dan endospora central menunjukkan bahwa letak endospora tersebut di bagian tengah sel vegetatif (Madigan dkk., 2012).
Endospora juga dikelompokkan berdasarkan bentuknya yaitu oval dan spherical. Endospora berbentuk oval dibagi lagi menjadi endospora yang sporanya tidak mengalami pembengkakan sehingga dinding sel endosporanya tipis, serta endospora yang sporanya mengalami pembengkakan sehingga dinding selnya tebal, hal tersebut juga berlaku pada endospora dengan bentuk spherical (Madigan dkk., 2012).
Mekanisme pembentukan endospora dimulai dengan DNA dari sel vegetatif bakteri mengalami pemanjangan dan replikasi sehingga menghasilkan dua kromosom. Selanjutnya, salah satu dari dua kromosom DNA tersebut mengalami pemadatan di daerah ujung sel diikuti dengan membran sel vegetatif mendorongnya ke ujung dan mulai membentuk septum. Selanjutnya, septum yang membatasi akan benar-benar terbentuk dan spora tahap awal (forespore) terbentuk dan memotong kelebihan sel. Selanjutnya, lapisan terluar atau korteks dari endospora mulai terbentuk mengelilingi spora tahap awal dan sebagian coat mulai dibentuk. Selanjutnya, dinding spora telah selesai dibentuk dan spora dewasa tersebut telah terbentuk dan selanjutnya sel akan melepaskan spora tersebut sebagai spora yang bebas dan strukturnya telah dilengkapi dengan coat yang sempurna, proses pembentukan spora tersebut pada bakteri dilakukan untuk menjadikan kondisi dorman atau istirahat dan prosesnya disebut sebagai sporulasi (Weeks dan Alcamo, 2008).
DAFTAR PUSTAKA
Aneja, K. R. 2003. Experiments in Microbiology Plant Pathology and
Biotechnology. New Age International Publishers: New Delhi
Austin, Brian, dan Dawn A. Austin. 2012. Bacterial Fish Pathogens:
Disease of Farmed and Wild Fish. Springer Science & Business
Media Dordrecht Heidelberg: New York
Campbell, N.A., Jane B. Reece, dan Lawrence G. Mitchell. 2003.
Biologi. Penerjemah: Manalu. Erlangga: Jakarta.
Cheesbrough, Monica. 2006. Labroratory Practice in Tropical
Countries. Cambridge University Press: Australia.
Madigan, Michael T., David P. Clark, David Stahl, dan John M.
Martinko. 2012. Brock Biology of Microorganism. Pearson
Education, Inc: San Francisco.
Maheswari, D. K. 2008. Potential Microorganisms for Suistainable
Agriculture: A Techno – Commercial Perspective. I. K.
International Publishing: New Delhi
McVey, D. Scott, Melissa Kennedy, dan M. M. Chengappa. 2013.
Veterinary Microbiology. Miley – Blackwell: London.
Maret 2015
Purnawijayanti, H. A. 2001. Sanitasi Higiene & Keselamatan Kerja
dalam Pengolahan Makanan. Kanisius: Yogyakarta.
Sumbali, G., dan R. S. Mehrotra. 2009. Principles of Microbiology. Tata
McGraw Hill Education Private Limited: New Delhi
Tan, James S., Thomas M. File, Robert A. Salata. Michael J. Tan. 2008.
Expert Guide to Infectious Disease. Versa Press Inc: USA.
Weeks, Benjamin S., dan I. Edward Alcamo. 2008. Microbes and
Society. Jones & Bartlett Learning: Canada
Maret 2015
25 Maret 2015
Yuwono, Triwibowo. 2001. Biologi Molekular. Erlangga: Jakarta.
Komentar