1.1 Dasar
Teori
Sentrifus adalah alat yang digunakan untuk mendapatkan
suspensi dari komponen
solid atau zat padatan
dalam zat cair dengan cara diputar dalam kecepatan
tinggi. Hasilnya adalah zat padatan tersebut akan
terpisah
dan menghasilkan sedimentasi di bagian dasar alat sentrifugasi. Sementara itu, zat
cairnya akan membentuk supernatan di bagian atas sentrifus. Fungsi dari
sentrifugasi adalah untuk memisahkan suatu zat dari suatu campuran dengan
menggunakan gaya sentrifugal (Mukherjee, 2000).
Sentrifugal berasal dari bahasa latin yaitu centrum yang berarti pusat, dan fugere yang berarti melarikan diri.
Menurut Sturtevant (2004),” Gaya sentrifugal adalah kecenderungan sifat dari
suatu benda untuk meninggalkan titik pusat ketika berputar dalam sebuah gerakan
melingkar.” Prinsip kerja dari sentrifugasi adalah pada saat terjadi
sentrifugasi, gaya sentrifugal dari perputaran yang terjadi mendorong zat padat
atau solid agar berpindah menuju densitas yang lebih tinggi dimana letaknya adalah
di ujung bagian bawah yang menyempit dari sentrifus dan terbentuklah endapan
yang disebut sebagai pelet, sementara itu zat cair akan terdorong ke tempat
dengan densitas lebih rendah yang terletak pada permukaan tabung (Mukherjee,
2000).
Tabung sentrifugasi atau sentrifus memiliki banyak
jenis,baik pada sentrifusnya maupun rotornya. Pada sentrifusnya, jenis
sentrifus yang biasa digunakan antara lain adalah general centrifuge, micro centrifuge, dan speciality centrifuge. General centrifuge memiliki bentuk yang
bisa diletakkan di atas meja dan digunakan untuk sentrifugasi urine, serum,
atau cairan dari zat padat yang tidak larut, kecepatannya berkisar antara
0-3000 rpm dengan banyak sampel terbatas maksimal 100ml. Micro centrifuge sesuai namanya mikro berarti kecil sehingga ukuran
sampel yang bisa ditampung maksimal 2ml. Specilaity
centrifuge ditujukan sebagai sentrifus yang memiliki fungsi spesifik
misalnya sentrifus microhematrocit dan sentrifus blood
bank. Sentrifus modern dengan kecepatan yang sangat tinggi di atas 50.000 rpm
disebut sebagai ultracentrifuges yang
dilengkapi dengan sistem pendinginan (Walker dan Rapley, 2000).
Tempat terjadinya fotosintesis di dalam
sel berupa sebuah struktur diskrit atau organel yang disebut sebagai kloroplas.
Sebagai organel seluler, kloroplas memiliki ukuran sedang dan lebih kecil dari
nuclei atau vakuola, tetapi sedikit lebih besar dari ribosom. Kloroplas di
dalam daun pada tumbuhan tingkat tinggi memiliki bentuk seperti cakram atau
wafer dengan diameter 5 mikrometer. Bagian-bagian penting pada kloroplas dapat
dilihat dengan menggunakan mikroskop elektron dan bagian-bagian tersebut antara
lain adalah sepasang lapisan terluar yang disebut envelope, tilakoid(terdapat klorofil) yang berbentuk kantong datar
yang berjalan ke sana kemari dalam kloroplas, lumen yaitu ruang di dalam
tilakoid, dan grana yaitu sekumpulan tilakoid yang tumpang tindih jadi satu(Hopkins,
2009).
Isolasi kloroplas atau untuk mendapatkan
ekstrak kloroplas, dapat digunakan sebuah eksperimen misal dengan menggunakan
daun bayam 25gram, daun-daun di potong dengan ukuran yang lebih kecil dan diletakkan
dalam blender yang sebelumnya telah didinginkan di dalam freezer. Kemudian ditambahkan
100ml bufer isolasi kloroplas dingin dan diblender 15 detik dalam kecepatan penuh,
hasil blender dituangkan dengan cara disaring ke dalam gelas beaker dalam
keadaan dingin. Selanjutnya 10ml filtrat dimasukkan dalam sentrifus 15ml dan
disentrifugasi selama 5 menit dalam kecepatan 1300g. Kemudian supenatan
dikeluarkan dan ditambahkan 2-2.5ml bufer isolasi dingin pada setiap pelet dan
diaduk dengan kuas lalu dituangkan ke dalam tabung. Hasilnya merupakan preparat
kloroplas yang masih mengandung komponen seluler. Hasil dari 12-15 ml dari preparat
kloroplas dapat digunakan untuk 300 uji tes dan dapat disimpan dalam lemari es
dalam waktu beberapa jam(Dean‡ dan Miskiewicz, 2003).
1.2
Tujuan
Praktikum
Tujuan
dilaksanakannya praktikum tentang “Koefisien Sedimentasi” ini yaitu:
1. 1. Melakukan isolasi kloroplas dari tanaman menggunakan
metode fraksionasi sel.
2. 2. Mengamati kloroplas hasil fraksionasi menggunakan
mikroskop.
3. 3. Mengetahui perkiraan koefisien sedimentasi kloroplas.
2.1
Prosedur Isolasi Fraksi Kloroplas
Langkah pertama yang
harus dilakukan adalah daun bayam dipisahkan dari tulang daun utamanya dan
ditimbang sebanyak 4 gram. Daun selanjutnya dipotong menjadi bagian-bagian
kecil dengan gunting, selanjutnya ditempatkan pada mortar dingin yang sudah
diisi dengan 15ml buffer Tris-NaCl sebelumnya, serta sedikit pasir kuarsa. Daun
tersebut dihaluskan dengan pestle selama 2 menit. Selanjutnya, suspensi dari daun
disaring menggunakan kain kasa dan filtratnya ditampung ke dalam gelas beaker
dan kemudian dipindahkan ke dalam tabung polipropilen dingin dan ditimbang
dengan berat 17 gram. Filtrat disentrifugasi dengan kecepatan 1250 rpm selama 1
menit. Hasil sentrifugasi yang berupa supernatan dipindahkan ke dalam tabung polipropilen
baru yang dingin, ditimbang dengan berat 17 gram dan disentrifugasi dengan kecepatan
3250 rpm selama 5 menit. Selanjutnya, dilakukan pengukuran jarak A yaitu jarak
dari dasar tabung propilen ke permukaan atas suspense dan jarak B yaitu jarak
dari dasar tabung propilen ke bagian atas pelet. Koefisien sedimentasi kloroplasnya
dihitung dengan rumus koefisien sedimentasi. Selanjutnya supernatan dibuang dan
kemudian peletnya ditambahkan dengan 10ml buffer Tris-NaCl dingin, dan diresuspensi
dengan pelet menggunakan pipet Pasteur. Selanjutnya, tabung polipropilen ditutup
dan dibalik-balik beberapa kali dan ditempatkan di ice-water bath. Diambil satu tetes suspense kloroplas menggunakan pipet
Pasteur dan diletakkan di atas obyek gelas dan ditutup cover gelas, kelebihan
cairan di sekitar cover gelas dihisap menggunakan tisu. Kloroplas diamati
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 200x, 400x, dan 1000x.
3.1 Analisa Prosedur
3.1.1 Fungsi Alat
Peralatan yang digunakan memiliki fungsinya
masing-masing secara spesifik. Alat yang pertama adalah mikroskop, mikroskop
merupakan alat yang berfungsi untuk mengamati struktur secara mikroskopis pada
suatu bahan, pada praktikum ini digunakan mikroskop elektron yang mampu
membentuk image lebih sempurna
dibandingkan dengan mikroskop cahaya biasa. Selanjutnya adalah alat
refrigerated-centrifuge, fungsi dari alat ini adalah untuk melakukan
sentrifugasi dalam keadaan dingin karena dilengkapi dengan pendingin sehingga
struktur subseluler tetap terjaga. Selanjutnya adalah tabung polipropilen,
fungsi tabung ini adalah sebagai tempat bahan yang akan disentrifugasi dalam refrigerated-centrifuge. Mortar dan pestle
merupakan sepasang alat yang fungsinya adalah untuk menumbuk bahan atau
menghaluskan bahan agar komponen-komponennya homogen. Gunting merupakan alat
yang digunakan untuk memotong daun. Pipet Pasteur berfungsi sebagai alat pemindah
bahan dengan ketelitian tertentu sehingga mengurangi terjadinya kelebihan ataupun
kekurangan. Obyek dan cover gelas merupakan sepasang alat yang digunakan
sebagai tempat sekaligus penutup specimen yang akan diamati dengan mikroskop. Penggaris
sebagai alat untuk membuat garis, ice-water bath berfungsi sebagai tempat pendingin
bahan agar suhu bahan tetap terjaga, kain kasa berfungsi sebagai alat penyaring.
Alat tambahan berupa timbangan atau neraca yang digunakan untuk menimbang berat
bahan yang akan disentrifugasi.
3.1.2 Fungsi Bahan
Bahan
yang digunakan pada praktikum ini antara lain adalah daun bayam segar
dan buffer Tris-NaCl dingin. Daun bayam dipilih menjadi preparat atau bahan
yang diamati kloroplasnya karena struktur daun bayam yang lunak dimana hal
tersebut membantu mempermudah praktikan untuk menghaluskan daun bayam sekaligus
menghancurkan dinding selnya sehingga komponen subselulernya dapat keluar dan
disentrifugasi, selain itu, daun bayam juga mempunyai kandungan kloroplas yang
banyak. Buffer Tris-NaCl dingin berfungsi sebagai larutan penyangga yang
bekerja untuk menjaga struktur fisiologi sel dan komponen subseluler sel yang
ada pada daun bayam.
3.1.3 Fungsi Perlakuan
Daun
bayam yang telah dipisahkan dengan tulang daun utamanya ditimbang 4gram dan
dimasukkan ke dalam mortar yang sebelumnya telah diisi dengan buffer Tris-NaCl
dan dihaluskan dengan pestle. Perlakuan dimana buffer Tris-NaCl dimasukkan
lebih dahulu berfungsi untuk menjaga struktur fisologis sel daun bayam karena
larutan tersebut merupakan larutan penyangga. Perlakuan selanjutnya adalah penyaringan
daun bayam yang telah halus untuk mendapatkan filtrate daun bayam dan dilakukan
penimbangan 17 gram, perlakuan penimbangan harus 17 gram untuk menjaga
keseimbangan dalam mesin sentrifugasi agar tidak terjadi gangguan dan kerusakan
pada mesin. Disentrifugasi 1250 rpm selama 1 menit berfungsi untuk memisahkan
debris dengan supernatan, dimana supernatan selanjutnya dipindah ke tabung polipropilen
baru dan disentrifugasi kembali 3250 rpm selama 5 menit berfungsi untuk mendapatkan
pelet yang merupakan kloroplas dari daun bayam, sedangkan supernatannya merupakan
subseluler yang memiliki densitas atau ukuran lebih kecil dari kloroplas,
diduga berisi nukleus. Selanjutnya kloroplas dalam bentuk pelet ditambahkan
dengan 10ml Tris-NaCl dan dihomogenkan untuk menjaga struktur fisiologis kloroplas
yang sudah didapatkan. Selanjutnya diambil satu tetes pelet dan diletakkan di
obyek gelas dan ditutup cover gelas untuk diamati struktur mikroskopis kloroplas
pada perbesaran 400x.
3.2 Analisa Hasil
3.2.1 Pengamatan
Menggunakan Mikroskop
Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa pada pengamatan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 400x,
dapat ditemukan beberapa kloroplas yang berwarna hijau muda dengan ukuran yang masih
sangat kecil sehingga tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya. Pengamatan
menggunakan mikroskop hanya dilakukan satu kali dengan perbesaran 400x karena
waktu pengerjaan atau praktikum yang sangat terbatas dan terjadi gangguan pada
mesin pada saat sentrifugasi dengan kecepatan 3250 rpm selama 5 menit, dimana
hal tersebut kemungkinan terjadi akibat bahan-bahan yang disentrifugasi dalam
refrigerated centrifuge secara bersamaan memiliki keseimbangan yang kurang atau
tidak seimbang. Kloroplas yang ditemukan memiliki bentuk lonjong seperti pil kapsul
yang berukuran sangat kecil.
Bentuk kloroplas pada
umumnya seperti cakram atau wafer dengan diameter 5 mikrometer. Bagian-bagian penting
pada kloroplas dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop elektron dan
bagian-bagian tersebut antara lain adalah sepasang lapisan terluar yang disebut
envelope, tilakoid(terdapat klorofil)
yang berbentuk kantong datar yang berjalan ke sana kemari dalam kloroplas,
lumen yaitu ruang di dalam tilakoid, dan grana yaitu sekumpulan tilakoid yang
tumpang tindih jadi satu(Hopkins, 2009).
3.2.3 Macam - macam Kloroplas
Macam-macam
kloroplas yang bervariasi dapat dilihat pada kloroplas
alga, dimana semua jenis kloroplas pada alga memiliki bentuk tunggal menyerupai
mangkuk. Kloroplas mengisi sebagian besar dari sel dan memiliki dasar yang
tebal sementara tepinya tipis. Bentuh dari kloroplas bervariasi yaitu retikulat
( C. reticulate), stelat ( C. arachne), bentuk huruf H ( C. biciliata), axile
dan stelat ( C. steinii), laminat( C. mucicola), cakram (C. alpine), dan
berlurik-lurik ( C. multitaeniata) (Gambar 3) (Pandey dkk., 2009).
Komentar